间充质干细胞体外修饰**急性肾损伤的研究进展

虽然早期预防及支持**有显著的疗效，但其发病率和病死率仍居高不下。细胞**是目前**AKI具有良好前景的策略，旨在促进损伤肾小管上皮细胞修复。其中间充质干细胞( MSC)因其具有干细胞多向分化潜能及易获取、易扩增、低**源性等特点，是*有希望、能方便用于AKI临床**的干细胞。

然而，MSC移植的低迁移率和低生存率等因素限制其功能的进一步发挥。为克服上述缺点，采用多种方法对MSC进行体外修饰或处理以期提高移植疗效，其中包括基因修饰、体外**预适应、体外低氧预处理等。本文就近年来MSC体外修饰方法及在AKI**中的研究进展作一综述。

一、间充质干细胞的主要特性

1968年，Friedenstein等*先对MSC的特性进行描述，认为该种细胞有黏附性、表型呈成纤维细胞样并具有多向分化潜能。1999年，Pittenger等**从骨髓中分离MSC (BMSC)。随后，陆续有文献报道，MSC还能从其他多种中分离，比如脂肪、脐血、胎盘、羊水、皮肤等。

近年来，学术界对MSC的研究日益增加。为了使MSC的研究更标准、更统一化，从而使研究结果更加具有可比性，2006年，细胞**协会(ISCT)制定了指南来定义MSC的基本特性：(1)塑料黏附性，即在标准培养条件下，细胞贴壁生长；(2)细胞表面表达CD73、CD90.CD105，而不表达CD45、CD34、CD14、CDllb、CD79a、CD19、HLAII类；(3)具有多向分化潜能，即在体外可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨母细胞。但是这份指南主要用于规范人类来源的MSC。动物体内分离的MSC，其黏附性和分化潜能基本上与人类保持一致，但有关抗原的表达有待进一步的确认。

*常用于获取MSC的来源是骨髓，即BMSC。尽管骨髓中BMSC占的比例较少(占骨髓有核细胞的0.OOl%-0.01%)，但其易分离、体外扩增迅速。BMSC细胞表面不表达或低表达MHC I类和MHCⅡ类分子，具有低**源性，体内输注能避开同种异体T细胞的攻击；另一方面可以细胞**或者先天**途径，发挥**抑制。

此外，虽然目前对于调节BMSC分化的机制尚不明确，但大量研究明，BMSC的分化潜能远远超过ISCT指南中描述的，即除了能分化为中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、软骨母细胞外，在特定的环境中，还能分化成外胚层起源的神经元细胞、内胚层起源的肝细胞，和心肌细胞等。上述特性使得BMSC成为*有希望、能方便用于临床的干细胞之一。

二、MSC移植**AKI的机制

动物实验发现，输注MSC能有效减轻AKI的肾脏损伤，促进肾脏修复。但对于MSC移植的肾脏保护机制目前仍有争议。虽然部分研究认为输注的MSC分化为肾小管上皮细胞而促进肾损伤修复、改善肾脏功能，但多数学者认为，输注的MSC迁移归巢至受损肾脏后，分泌促有丝分裂、促血管生成、抗凋亡、**性反应等相关细胞因子而发挥肾脏保护。

1．外源性MSC归巢至损伤肾脏：

输注的MSC归巢到损伤肾脏是细胞**的首要步骤。肾小管缺血缺氧损伤是AKI的主要病因。肾脏缺血后，机体释放一系列炎性因子、趋化因子和生长因子，从而引发复杂的急性炎性反应事件。

体外研究发现MSC能对炎性反应信号释放适应性**应答，从而启动MSC迁移过程。MSC膜表面表达一系列黏附分子和整合素，如CXCR4、c-Met、VCAM-1、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3等，它们帮助MSC黏附并内皮从而到达坏死肾小管区域。

其中MSC细胞表面表达的CXCR4、c-Met可以和受损肾小管上皮细胞表达的SDF-1、HGF等生物因子形成受体-配体关系，促进MSC迁移至受损肾脏部位。即SDF-1-CXCR4和HGF-c - Met轴是MSC黏附归巢*重要的信号，可促使MSC招募至损伤区域，促进**。

2．旁分泌：

移植的MSC可以释放一系列具有细胞保护的细胞因子和生长因子，后者抗凋亡、促进血管生成和促有丝分裂等机制保护损伤。下述分子为MSC释放的*常见的细胞因子和生长因子：血管内皮生长因子(VEGF)、p成纤维细胞生长因子(3-FCF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、基质源因子1(SDF-1)、转化生长因子p(TGF-(3)、白细胞介素6（IL-6）、肝细胞生长因子(HGF)、血管生成素I(Ang I)、血小板起源的生长因子(PDGF)、单核细胞-巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞集落刺激因子( GCSF)。

目前多数研究认为，在AKI肾小管修复过程中，移植的MSC在部炎性细胞和因子的刺激下，分泌上述细胞因子。这些细胞因子旁分泌的方式抑制部炎性反应，修复受损肾脏。特别是在AKI病程的早期，此时MSC尚不可能分化为肾小管上皮细胞，旁分泌功能被认为是其早期肾脏保护的主要机制。

3．分化或刺激肾脏原位MSC分化为肾小管上皮细胞：

有研究发现，肾小管损伤后的体外条件培养基可诱导MSC表达肾小管上皮细胞表型，提示MSC具有向肾小管上皮细胞分化的潜能。这些损伤的肾小管会释放一系列可溶性损伤因子，包括多种生长因子、细胞因子、趋化因子和白细胞介素等，诱导MSC分化为肾小管上皮细抱。

体内研究显示，输注外源性MSC至大鼠AKJ模型，2周后发现MSC输注组的肾功能改善较对照组明显；同时植入的MSC表达水通道蛋白1(AQPl)、仪平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、CK-18等肾小管上皮细胞特异性，认勾移植的MSC分化为肾小管上皮细胞，参与AKI的肾脏修复过程。但是，MSC体内分化为肾小管细胞仅占增生肾小管上皮细胞的少部分，MSC输注后第8天，分化ISC数量约占输注总MSC数量的0.1%或者更少。

多项研究表明，MSC输注到AKI模型后，有利出现的时间早，大约在移植术后24 h，尚不足以提供足够的时间让MSC分化为肾小管上皮细胞。至少在受损肾脏修复的前期过程中，“MSC分化为肾小管上皮细胞”还不足以解释AKI后细胞输注对肾脏的修复机制。

此外，有研究发现肾脏肾小球和近端肾小管有肾脏：细胞定植，该细胞表达CD133、PAX-2、nestin等。输注的外源性MSC分泌的HGF和IGF-1等肾脏保护因子，能促进肾脏干细胞向肾小管上皮细胞分化，促进肾脏内源性的自我修复。

三、体外修饰MSC可激发间充质干细胞的**潜能

虽然目前多数研究支持MSC移植可以**AKI，但仍存在一些问题：(1)输注MSC只有少量细胞归巢到缺血肾，大部分嵌顿在心、肺、脾等其他器官；(2)缺血肾脏的部低氧和炎性反应，降低了迁移至此的MSC的存活率；(3)移植MSC归巢后异常分化为脂肪细胞。上述问题大大降低了MSC对AKI的保护，进而限制其进一步的临床应用。

近年来，一些学者尝试对MSC进行体外预处理后再移植，以期解决上述难题。这些预处理方法包括基因修饰、低氧预处理和**预处理等，并初步成效，分述如下。

1. 体外基因修饰策略：

MSC具有低**源性且能趋化、迁移至受损器官参与修复，因此被视为理想的基因转染介质。激肽释放酶能保护器官对抗氧化应激的损伤。

Hagiwara等叫将人激肽释放酶基因转染至MSC(TK-MSC)，体外实验发现，TK-MSC能分泌重组人激肽释放酶，且培养基中释放的血管内皮生长因子(VECF)较普通MSC高，氧化应激引起的细胞凋亡数也明显降低；将TK-MSC左颈动脉输入动物模型后发现，移植后6 h。TK -MSC组肾小管凋亡、诱导型氮氧化物合酶(iNOS)及NO表达均减少；移植后48 h，间质炎性细胞浸润减少，髓过氧化酶活性降低，肿瘤坏死因子(TNF)仪、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、胞间细胞黏附分子1(ICAM-1)的表达下调，由此实激肽释放酶和激肽能抑制H202诱导的细胞凋亡、增加Akt磷酸化和体外培养的肾小管细胞的活性。在机体AKI微环境中，红细胞生成素(EPO)能促进MSC的存活、增生和分化。

Eliopoulos等在体外用EPO基因转染至MSC (EPO-MSC)，再将EPO-MSC腹腔注射的方式输入AKI小鼠模型后发现，Epo -MSC在小鼠AKI模型体内的生存率较普通MSC高；Epo-MSC组肾内EPO表达上调，血尿素氮和肌酐水平也下降。分泌VEGF是MSC发挥肾脏保护方面的重要因素。

Yuan等将VEGF基因转染至MSC (VEGF-MSC)，并与损伤的肾小管上皮细胞TCMK-1共培养，TCMK-1在损伤后第3天，细胞活力下降；与MSC共培养时，VEGF-MSC对细胞的保护较单纯MSC明显；将VEGF-MSC尾静脉输入AKI小鼠模型后发现，VEGF-MSC的肾脏保护优于单纯MSC，主要体现在肾功能、小管结构、细胞生存率的改善。肝细胞生长因子(HGF)是一种**调节因子，能促进血管生成，减少损伤释放的炎性细胞因子。

Chen等将HGF体外转染至MSC (HGF-MSC)，后将细胞左颈动脉输入大鼠AKI模型后发现，损伤后72 h,HGF-MSC组肌酐和尿素氮下降至基线的速度较MSC组迅速，肾脏充血和肾小管管型的程度较轻。上述结果表明，适当的体外基因修饰能提高MSC的**潜能，增加干细胞增生、减少凋亡，减轻肾炎性反应、改善微循环等机制，从而更有效的减轻肾损伤、促进肾修复。

2．体外**预处理策略：

DHA在炎性反应环境中能产生有效的**脂质介质，比如14S，21R- diHDHA。Tian等在MSC培养基中加入250 nmol/L的14S, 21R -diHDHA，孵育12 h后，将细胞输注入小鼠AKI模型体内，结果发现，预处理组能更有效地减少肾脏结构的改变，降低血肌酐上升的水平，抑制肾小管细胞的凋亡和炎性细胞浸润；在体外试验中，14S，21R-diHDHA预处理能刺激MSC分泌更多的HGF、IGF-1等肾脏保护因子，并磷酸肌醇3-激酶-Akt信号通路提高MSC的活力。

同时，上述体外实验结果在人MSC中亦得到实。褪黑素能降低氧化应激损伤从而减少损伤，并刺激骨髓系统分泌细胞因子。Mias等在MSC培养基中加入5pcmoVL褪黑素，孵育24 h后清洗、消化细胞，并直接注入大鼠AKI模型的肾皮质，结果发现，与单纯MSC组比较，褪黑素预处理组MSC的存活率提高，受累肾脏的血管生成增加、肾小管细胞增生及肾功能改善明显；体外实验进一步发现，褪黑素能诱导超氧化剂物歧化酶-1的过度表达，从而增加MSC的抗凋亡能力；同时，褪黑素预处理的MSC高表达FGF和HCF，从而增加其在体存活率、旁分泌活性和效能。

透明质烷。丁酸(HB)是一种合成复合物，体外能诱导后肾分化，****样结构形成，分泌血管生成因子。La Manna等口71用l g/L HB体外预处理MSC(HB-MSC)后将其输人大鼠AKI模型体内，发现HB-MSC组的肾脏炎性反应程度略较MSC组低，推测HB预处理能增强MSC的修复诱导能力。

3．体外低氧预适应策略：

正常情况下，骨髓处于低氧状态，氧含量为1%~ 7%。目前大部分实验涉及的MSC是在常氧培养箱中扩增得到。事实上，一旦在体外常氧条件下培养时间超过24 h，能定向归巢的MSC数量就明显减少；进一步发现，随着体外细胞传代次数的增加，MSC细胞表面表达的包括CXCR4在内的黏附分子数目逐渐减少，对趋化因子的反应能力进行性下降。因此常规的体外培养过程将限制MSC向脏器缺血部位归巢。

于是Hung等假设体外低氧培养能提高MSC的在体归巢和迁移能力，他将MSC置于氧含量为1%的环境中短期培养，发现能有效提高MSC表面的趋化因子受体CXCR1和CXCR4的表达，同时增强MSC对趋化因子CX3和SDF-la的迁移能力，即体外低氧预适应能提高MSC的迁移能力。Liu等对上述实验进行了深入研究，发现在缺血肾脏中，SDF - lα表达上调，该因子与MSC表面表达的CXCR4、CXCR7形成配体。

受体关系，调节MSC向损伤肾脏迁移；低氧培养能促进MSC表面CXCR4和CXCR7的表达；与常氧培养的MSC相比，低氧培养不仅能改善MSC的趋化归巢和细胞活力，还能刺激促血管生成和促有丝分裂等细胞因子分泌。

其中，CXCR4和CXCR7是低氧预适应发挥旁分泌的重要因子。缺血再灌注发生24 h后，输注的低氧预处理后的MSC能靶向趋化到缺血肾脏，而常氧培养的MSC则不明显。若封闭CXCR4或CXCR7则削弱低氧预处理MSC引起的改善的**潜能。该研究实了低氧预适应SDF -1 - CXCR4/CXCR7途径调节MSC趋化归巢，提高细胞活力，促进其旁分泌，加速有丝分裂，减少细胞凋亡，从而改善肾功能。

我们的研究也发现，化学低氧预处理（200 μl/L CoCl2培养24 h）可以增强MSC的体外迁移能力，该与低氧预处理活化HIF - lα后促进CXCR4的转录增加有关；体内实验发现，低氧预处理可以增加MSC向受损肾脏内定植的数量和延长在肾脏内定植的时间，从而更有效减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤。由于低氧预处理不需使用额外的生长因子、病毒或其它非临床用的**，因此是一种有前景的干细胞移植策略。

四、结论

虽然许多研究实MSC可促进AKI肾脏修复，但是输注MSC归巢率低、生存率低等原因，降低了MSC对AKI的保护。本文归纳的体外调控MSC的策略，主要促进MSC归巢、增强归巢细胞的旁分泌和***，改善MSC生存微环境，提高其体内生存率，从而增强MSC对损伤肾脏的修复。

但MSC**AKI的研究仍存在一些问题需要进一步确认：(1)MSC促进损伤肾脏修复的具体旁分泌机制及相应信号通路；(2)外源植入的MSC是否分化为肾小管上皮细胞，若存在分化，分化的MSC以何种机制参与损伤修复；(3)若存在肾脏干细胞，外源性MSC与肾脏干细胞如何相互。随着上述问题的解决，相信人们能更深刻地理解MSC对AKI的机制，为后期的临床试验奠定良好的基石。